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創(chuàng)建用于內(nèi)毒素加標(biāo)研究和LAL樣品保持時(shí)間分析的內(nèi)部天然內(nèi)毒素制劑

發(fā)布時(shí)間: 2024-07-16  點(diǎn)擊次數(shù): 1160次

摘要

檢測生物制藥產(chǎn)品中可能存在的內(nèi)毒素對患者安全至關(guān)重要。雖然內(nèi)毒素分子本身是高度穩(wěn)定的,但基質(zhì)成分、儲存溫度和容器組成等各種因素都會影響其在制造收集并隨后檢測內(nèi)毒素含量的樣品時(shí)的穩(wěn)定性。

位于馬薩諸塞州安多弗的輝瑞制藥公司開發(fā)了一個(gè)程序,用于創(chuàng)建內(nèi)部天然內(nèi)毒素(NOE)制劑,以評估內(nèi)毒素在不同基質(zhì)、溫度和容器中的穩(wěn)定性。使用NOE比使用市售的細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品(CSE)更有優(yōu)勢,如增加實(shí)驗(yàn)室的靈活性和控制,輝瑞公司已使用內(nèi)部天然內(nèi)毒素(NOE)制劑來評估內(nèi)毒素在不同基質(zhì)和溫度下的穩(wěn)定性。

介紹

內(nèi)毒素是一種脂多糖結(jié)構(gòu),位于革蘭氏陰性細(xì)菌的細(xì)胞壁中。由于內(nèi)毒素屬于一類被稱為熱原的致熱物質(zhì),因此可能含有內(nèi)毒素的腸外用藥產(chǎn)品會引起患者的熱原反應(yīng)。

FDA規(guī)定的內(nèi)毒素限值為5EU/kg體重。超過此含量的內(nèi)毒素限值可能會導(dǎo)致發(fā)燒、休克和死亡。出于安全性和合規(guī)性的考慮,在生物制造過程和產(chǎn)品中監(jiān)測和控制內(nèi)毒素含量至關(guān)重要。

鱟試劑(LAL)檢測法通常用于檢測生物制品中的內(nèi)毒素含量。檢測貫穿于整個(gè)純化過程以及原料藥和成品藥生產(chǎn)過程的各個(gè)環(huán)節(jié)。有效的內(nèi)毒素檢測對于產(chǎn)品的安全性非常重要。因此,準(zhǔn)確檢測產(chǎn)品生產(chǎn)和釋放過程中可能存在的任何內(nèi)毒素至關(guān)重要。

盡管人們普遍認(rèn)為內(nèi)毒素分子本身具有高度穩(wěn)定性,但各種基質(zhì)、溫度和/或儲存容器都可能影響鱟試劑(LAL)檢測法檢測內(nèi)毒素存在的能力。在馬薩諸塞州安多弗的輝瑞??谱o(hù)理中心啟動了多項(xiàng)研究來探討這些影響。 為了測量時(shí)間和/或溫度對內(nèi)毒素回收的影響,有必要在起始生物制藥樣品中加入內(nèi)毒素。由于要對多種基質(zhì)和溫度進(jìn)行評估,因此需要大量的內(nèi)毒素才能完成這些研究。

細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品(CSE)是一種商業(yè)上可用的內(nèi)毒素類型。CSE用于為鱟試劑(LAL)檢測法準(zhǔn)備標(biāo)準(zhǔn)曲線和陽性產(chǎn)品對照(PPC)。CSE由獲得許可的鱟試劑供應(yīng)商從純化的大腸桿菌菌株中制備,并在配方中含有填充劑。因此,CSE并不代表實(shí)際污染事件中可能存在的內(nèi)毒素。此外,CSE通常不適用于高濃度的EU/mL配方。

自然產(chǎn)生的內(nèi)毒素(NOE)由革蘭氏陰性細(xì)菌產(chǎn)生,經(jīng)過過濾但未經(jīng)進(jìn)一步處理,使其成為污染事件的代表性物質(zhì)。此外,由于它可以培養(yǎng)到非常高的EU/mL濃度,因此適合用于加標(biāo)研究。

生物體的選擇

對多種革蘭氏陰性生物體進(jìn)行篩選以產(chǎn)生NOE,以確定用于產(chǎn)生NOE制劑的潛在候選物。所有NOE溶液均通過在胰蛋白酶大豆瓊脂(TSA)上制備草坪培養(yǎng)物并在32°C下孵育24-48小時(shí)來制備。從培養(yǎng)皿中取出菌落,接種到胰蛋白酶大豆肉湯(TSB)中,在32°C的振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。將所得培養(yǎng)物離心,用0.45μm過濾器過濾,并使用動態(tài)顯色法鱟試劑檢測內(nèi)毒素。表1-1列出了所評估的每種生物的EU/mL值。

先前在馬薩諸塞州安多佛的輝瑞公司基地使用大腸桿菌和粘質(zhì)沙雷氏菌制劑進(jìn)行的NOE加標(biāo)研究非常有用,因?yàn)樗鼈儺a(chǎn)生了高濃度的EU/mL儲備溶液,并且在很長一段時(shí)間內(nèi)保持穩(wěn)定。產(chǎn)生高濃度內(nèi)毒素的生物體特別適用于加標(biāo)研究,因?yàn)檫@些制劑可以靈活地測試低和高的加標(biāo)濃度。

由于這些制劑產(chǎn)生的內(nèi)毒素濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于常規(guī)使用時(shí)的水平,因此每次使用前都必須確認(rèn)實(shí)驗(yàn)室制備的NOE儲存液的濃度,以便制備準(zhǔn)確的加標(biāo)溶液。

LAL驗(yàn)證與LAL加標(biāo)研究

在產(chǎn)品生產(chǎn)和發(fā)布過程中對LAL檢測進(jìn)行常規(guī)使用驗(yàn)證時(shí),會將CSE形式的內(nèi)毒素作為PPC添加到已稀釋的樣品中,以評估基質(zhì)抑制/增強(qiáng)作用。驗(yàn)證活動重點(diǎn)關(guān)注干擾因素測試,通過確定PPC加標(biāo)回收率(即,加標(biāo)到PPC中的內(nèi)毒素的回收率必須達(dá)到 50-200%)來評估樣品基質(zhì)是否會干擾內(nèi)毒素檢測。當(dāng)加標(biāo)回收率在可接受的PPC加標(biāo)回收范圍內(nèi),并且與USP第<85>章中設(shè)定的參數(shù)一致時(shí),選擇樣品稀釋。

LAL驗(yàn)證研究的設(shè)計(jì)通常會考慮到樣品基質(zhì)的影響,即樣品稀釋到一定程度后,檢測中不再出現(xiàn)干擾,這是由稀釋樣品中PPC加標(biāo)回收率決定的。在這種情況下,PPC中的內(nèi)毒素只有在稀釋后才會與樣品發(fā)生作用,而不是在開始時(shí)。

為了確定樣品基質(zhì)對內(nèi)毒素的影響,在進(jìn)行常規(guī)LAL檢測之前,內(nèi)毒素必須與未稀釋的樣品基質(zhì)相互作用。

使用NOE最初加標(biāo)未稀釋的樣品更能代表污染事件,因?yàn)檫@種污染的來源很可能是細(xì)菌來源,而不是來自加工后的內(nèi)毒素來源(如CSE)。

PPC加標(biāo)和NOE加標(biāo)的作用之間的主要區(qū)別在于,PPC加標(biāo)提供有關(guān)樣品基質(zhì)是否干擾檢測本身的檢測措施的信息,而NOE加標(biāo)提供有關(guān)樣品基質(zhì)與內(nèi)毒素直接相互作用的信息。圖1說明了使用動力學(xué)LAL檢測法進(jìn)行常規(guī)檢測和NOE加標(biāo)研究之間的區(qū)別。

圖1. 常規(guī)LAL檢測與NOE檢測對比研究

保持時(shí)間研究的設(shè)計(jì)

在許多情況下,LAL樣品運(yùn)到檢測實(shí)驗(yàn)室后,要放置一段時(shí)間才能開始檢測。應(yīng)進(jìn)行研究,以評估該保持時(shí)間對特定樣品類型內(nèi)毒素回收的影響。NOE對于這些研究非常有用,因?yàn)閷?shí)驗(yàn)室可以很容易地制備和儲存高濃度的EU/mL儲存液,從而可以相對簡單地制備出各種內(nèi)毒素濃度的加標(biāo)樣品。

在進(jìn)行LAL檢測之前,通過在未稀釋的樣品中添加NOE來進(jìn)行保持時(shí)間研究。立即對加標(biāo)樣品進(jìn)行分析以確定起始濃度,并在設(shè)定的時(shí)間點(diǎn)儲存和分析等分試樣。通過在未稀釋的樣品中加入NOE,可以在初始時(shí)間點(diǎn)以及樣品的儲存時(shí)間和溫度下確定產(chǎn)品和基質(zhì)對可能存在的任何內(nèi)毒素的影響。在這些研究中使用動力學(xué)LAL測定法,因?yàn)榻Y(jié)果是定量的,可以確定每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的內(nèi)毒素量。

表1-2顯示了在2-8°C溫度下將兩種不同的緩沖液保持3周時(shí),使用摻入NOE的兩種緩沖液進(jìn)行保持時(shí)間研究的結(jié)果,表1-3顯示了在-80°C溫度下,將兩種緩沖液保持3個(gè)月時(shí),使用摻入相同兩種緩沖液進(jìn)行保持時(shí)間研究的結(jié)果。這些結(jié)果表明,無論在何種溫度下,內(nèi)毒素都可以從緩沖基質(zhì)中回收。

保持時(shí)間研究的一個(gè)重要考慮因素是確認(rèn)最初加入的內(nèi)毒素量。當(dāng)NOE加入后直接測定起始時(shí)間點(diǎn)時(shí),必須考慮樣品基質(zhì)是否對內(nèi)毒素回收率有直接影響。為了證明沒有樣品基質(zhì)干擾,在無熱原水(LRW) 中進(jìn)行了相同的加標(biāo)。表1-4說明了此無熱原水加標(biāo)確認(rèn)的使用情況。本研究使用了三種不同的NOE加標(biāo)水平,由目標(biāo)NOE加標(biāo)量表示。測試樣品和無熱原水欄下的實(shí)際回收量在LAL測定可變范圍內(nèi),且表明不存在樣品基質(zhì)的干擾。

起始時(shí)間點(diǎn)測試和使用NOE進(jìn)行故障排除

以下研究(表1-5)清楚地說明了在無熱原水中對起始時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行加標(biāo)確認(rèn)的重要性。將NOE加標(biāo)到測試樣品中并立即進(jìn)行測定以確定起始NOE濃度。NOE以三種不同的濃度加標(biāo),由目標(biāo)NOE加標(biāo)表示。在所有三種加標(biāo)水平的稀釋度測試中,內(nèi)毒素回收率均低于檢測限值。然而,由于沒有進(jìn)行無熱原水確認(rèn),因此很難確定是否存在稀釋或測定誤差,或?qū)嶋H的基質(zhì)或產(chǎn)品干擾。

這項(xiàng)研究以兩種不同的加標(biāo)水平重復(fù)進(jìn)行,無熱原水確認(rèn)樣品與測試樣品同時(shí)進(jìn)行(表1-6)。添加無熱原水確認(rèn)樣品清楚地表明,樣品基質(zhì)存在干擾,導(dǎo)致檢測樣品中無法檢測到內(nèi)毒素。

在這種情況下,需要進(jìn)行多項(xiàng)研究來確定樣品基質(zhì)干擾的原因。 使用實(shí)驗(yàn)室制備的NOE儲存液提高了實(shí)驗(yàn)室在短時(shí)間內(nèi)進(jìn)行多項(xiàng)研究的效率,并允許使用從5EU/mL到3500 EU/mL的加標(biāo)濃度。表1-7顯示了一項(xiàng)使用不同測試樣本的研究數(shù)據(jù),該樣本的 NOE加標(biāo)非常低(5-40 EU/mL)。在這種情況下,測試樣本和無熱原水確認(rèn)樣本的內(nèi)毒素回收率是一致的,表明沒有基質(zhì)干擾。

研究人員還使用了來自幾種不同生物的制備物,為收集到的數(shù)據(jù)增加了穩(wěn)定性和可變性。這突出了使用內(nèi)部NOE制備物的額外好處,因?yàn)閬碜远喾N生物的制劑可以在需要時(shí)快速制備和使用。

表1-8顯示了使用表1-5和表1-6中的相同測試樣本生成的部分?jǐn)?shù)據(jù),其中有來自高濃度EU/mL NOE生成物(粘質(zhì)鏈霉菌)和低濃度EU/mL NOE生成物(A. 基因組)的加標(biāo)。 兩者的目標(biāo)濃度均為200 EU/mL,并顯示出相似的回收率,進(jìn)一步表明測試樣品干擾了內(nèi)毒素的回收,而不是任何檢測錯(cuò)誤或特定內(nèi)毒素來源的問題。

結(jié)論

本報(bào)告中提供的數(shù)據(jù)用于說明測試各種基質(zhì)、溫度和儲存時(shí)間對在測試前將在實(shí)驗(yàn)室中放置一段時(shí)間的樣品的內(nèi)毒素回收的干擾的重要性。了解內(nèi)毒素和樣品基質(zhì)在起始時(shí)間點(diǎn)的相互作用尤為重要,因?yàn)榇藭r(shí)可能存在的任何基質(zhì)抑制都會被識別。在執(zhí)行此測試或?qū)υ贜OE被摻入測試樣品基質(zhì)時(shí)表現(xiàn)出抑制的基質(zhì)進(jìn)行故障排除時(shí),使用實(shí)驗(yàn)室制備的NOE原液大大增加了可用的測試選項(xiàng)的靈活性、效率和范圍。當(dāng)在起始時(shí)間點(diǎn)遇到基質(zhì)抑制時(shí),需要開發(fā)替代測試方法,在這種情況下NOE也非常有用,因?yàn)榇_認(rèn)內(nèi)毒素是否成功回收對于任何替代方法的實(shí)施都至關(guān)重要。


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